Umwelt-DNA-Untersuchung
eDNA-Analytik aus Wasser-, Sediment, Detritusproben
Detektion von Arten und Nahrungsketten
für Natur- und Artenschutz, Monitoring und Management invasiver Arten
ETWG eDNA Community of Practice
The 4th annual Environmental DNA Technical Exchange Workshop (4eDTEW) will be a virtual workshop that emphasizes methods for environmental DNA (eDNA) and eDNA metabarcoding studies (or eRNA studies), from study design through assay design, sample collection, processing, and results interpretation, and on to post-survey decision-making. The dates of the workshop are 4-6 Nov, 2020.
FAQ
eDNA
Abkürzung für „Environmental DNA“. Bezieht sich auf DNA, die in der Umwelt durch Ausscheidung, Ablagerung, Schleimabsonderung, Speichel usw. hinterlassen wird. Diese kann in Umweltproben (z.B. Wasser, Sediment) gesammelt und zur Identifizierung der Organismen verwendet werden, aus denen sie stammt. eDNA im Wasser wird über einen Zeitraum von Tagen bis Wochen durch Umweltprozesse abgebaut. Sie kann eine gewisse Entfernung von dem Ort entfernt sein, an dem es aus dem Organismus freigesetzt wurde, insbesondere im fließenden Wasser. Die eDNA im Boden kann sich an organische Partikel binden und sehr lange (manchmal Hunderte oder Tausende von Jahren) bestehen bleiben. eDNA wird in niedrigen Konzentrationen gesampelt und kann abgebaut (d.h. in kurze Fragmente zerlegt) werden, was die Analysemöglichkeiten einschränkt.
PCR / amplification
Polymerase-Kettenreaktion. Ein Verfahren, bei dem Millionen von Kopien eines bestimmten DNA-Segments durch eine Reihe von Heiz- und Abkühlungsschritten hergestellt werden. Bekannt als „Verstärkungsprozess“. Einer der häufigsten Prozesse in der Molekularbiologie und Vorläufer der meisten sequenzbasierten Analysen.
Primer
Kurze Abschnitte synthetisierter DNA, die an beide Enden des DNA-Segments binden, welches durch PCR amplifiziert werden soll. Kann so konzipiert werden, dass sie völlig spezifisch für eine bestimmte Spezies sind (so dass nur die DNA dieser Spezies aus einer Community-DNA-Probe amplifiziert wird), oder sehr allgemein, so dass eine breite Palette von DNA amplifiziert wird. Gutes Design von Primern ist einer der kritischen Faktoren bei der DNA-basierten Untersuchung (monitoring).
qPCR
Steht für „quantitative PCR“, manchmal auch bekannt als „real-time PCR“. PCR-Reaktion mit einem farbigen Kontrastmittel, das während der Amplifikation fluoresziert, so dass eine Maschine den Fortschritt der Reaktion verfolgen kann. Häufig verwendet mit artspezifischen Primern, bei denen der Nachweis der Amplifikation verwendet wird, um das Vorhandensein der DNA der Zielart in der Probe nachzuweisen. Wenn die Spezies nicht in der Probe vorhanden ist, wird keine Fluoreszenz nachgewiesen. Die hohe Spezifität der qPCR-Methode macht sie ideal für Situationen, in denen ein einziges Ziel erfordert wird. Der häufigste Einsatz von qPCR-Tests ist der Nachweis von Great Crested Newts aus Wasserproben.
Community DNA
Bezieht sich auf DNA, die aus einer Mischung verschiedener Organismen gewonnen wird. Dies kann eDNA (Umweltproben enthalten fast immer DNA aus einer Mischung von Spezies) oder organismische DNA (z.B. homogenisierte Insektenfallenproben) sein.
Sanger Sequenzierung
Traditionelle DNA-Sequenzierung. Jede Reaktion erzeugt eine einzelne Sequenz, so dass sie nur auf amplifizierter DNA einer einzelnen Spezies funktioniert. Eine Sequenz ist eine Reihe von Nukleotidbasen, die durch die Buchstaben A, T, C & G dargestellt werden. Hier ist die Sequenz eines Teils des 12S-Gens für einen Elritzen (Phoxinus phoxinus): CACCGCGGTTAAACGAGAGGCCCTAGTTAATAATTGACGGCGTAAAG GGTGGTTAGGGGGTGTAATGTAATAAAGCCGAATGGCCCTTTGGCTG TC ATACGCTTCTAGGTGTCCGAAGCCCAACATACGAAAGTAGCTTTA AGAAAGTCCACCTGACGCCACGAAAACTGAGAAA
High-Troughput Sequencing
In den 2000er Jahren entwickelte Technologie, die Millionen von Sequenzen parallel erzeugt. Ermöglicht die gleichzeitige Sequenzierung von Tausenden verschiedener Organismen aus einer Artenmischung, so dass Gemeinschafts-DNA sequenziert werden kann. Dazu gibt es viele verschiedene Technologien, aber die am häufigsten verwendete Plattform ist Illumina’s MiSeq. Auch bekannt als Next-Generation Sequencing (NGS) oder Parallel-Sequencing.
Barcode Genes
Bezieht sich auf Gene, die für die Identifizierung von Arten verwendet werden können. Verschiedene Regionen der DNA mutieren mit unterschiedlicher Geschwindigkeit. Schnell wechselnde Regionen sind nützlich für Populationsstudien und Vaterschaftstests, während die stabilsten Regionen zur Abschätzung tiefer evolutionärer Beziehungen zwischen Organismengruppen verwendet werden können. Bestimmte Regionen ändern sich in genau der richtigen Geschwindigkeit, um innerhalb einer Art stabil zu sein, aber zwischen den Arten unterschiedlich. Diese werden als Barcodegene bezeichnet. Das offizielle Barcodegen für Tiere ist die Cytochrome Oxidase 1 (COI oder cox-1). Andere Gene, die als tierische Barcodes verwendet werden, sind 12S, 16S, 18S und Cytochrome-b (cytb). Für Pflanzen sind die am häufigsten verwendeten Gene MatK, rbcL, trnL und ITS.
Metabarcoding
Bezieht sich auf die Identifizierung von Artenzusammensetzungen aus der Community-DNA unter Verwendung von Barcode-Genen. Die PCR wird mit unspezifischen Primern durchgeführt, gefolgt von high-throughput sequencing und bioinformatischer Verarbeitung. Kann Hunderte von Spezies in jeder Probe identifizieren, und mehr als 100 verschiedene Proben können parallel verarbeitet werden, um die Sequenzierungskosten zu senken.
Reference Database
Bezieht sich auf Bibliotheken von DNA-Sequenzen (meist aus Barcode-Genen), die von Arten bekannter Identität generiert wurden. Sequenzen von nicht identifizierten Organismen – entweder durch Sanger-Sequenzierung oder high-throughput sequencing gewonnen – werden mit einer Referenzdatenbank verglichen, um Artenidentifikationen vorzunehmen. Datenbanken können kuratiert (z.B. die Barcode of Life Database – BOLD – www.boldsystems.org) oder unkuratiert (z.B. Genbank – www.ncbi.nlm.nih.gov) werden. In kuratierten Datenbanken werden Identifikationen überprüft und verifiziert, in unkuratierten Datenbanken nicht. GenBank ist daher weitaus umfangreicher als BOLD, enthält aber viele Fehler.
Bioinformatics
Bezieht sich auf eine Datenverarbeitungspipeline, die die Rohdaten der high-throughput sequencing (oft 20 Millionen Sequenzen oder mehr) in brauchbare ökologische Daten umwandelt. Wichtige Schritte für die Metabarcodierung von Pipelines sind Qualitätsfilterung, Trimmen, Zusammenführen gepaarter Enden, Entfernen von Sequenzierungsfehlern wie Chimären, Clustering ähnlicher Sequenzen zu molekularen taxonomischen Einheiten (von denen jede ungefähr eine Spezies darstellt) und Abgleichen einer Sequenz aus jedem Cluster mit einer Referenzdatenbank. Der Output ist eine species-by-sample-Tabelle, die zeigt, wie viele Sequenzen aus jeder Probe als jede Art identifiziert wurden.
Kontakt
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Diplombiologe Jens Tauchert
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